Tiosbio? RT RAA核酸扩增试剂盒（荧光法）

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Fri, 22 Mar 2024 08:27:46 +0000
SNP可视化检测系统, DNA扩增, JY0205, 核酸扩增

本试剂盒利用特殊修饰的反转录酶以特异性引物作为转录引物，将体系内的RNA逆转录为cDNA，并以重组酶介导等温核酸扩增（Recombinase Aided Amplification，RAA）技术对检测目标序列进行扩增。在等温条件下（通常为42℃），RAA体系内的重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体 Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白 SSB 的帮助下，侵入cDNA 模板或双链DNA产物内；在侵入位点形成 D-loop 区域，并开始对 DNA 链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体 Rec/ssDNA 解体的同时，聚合酶也结合到引物的 3′ 末端，以样品DNA为模板，12 ~?20?min即可实现对目的基因片段的高效扩增。扩增体系含有正、反向扩增引物和特异性的分子探针。在?42 ?C 下，特殊修饰的探针经过exo?酶的切割后，可使用荧光监测设备对目标片段扩增过程进行实时监控。适用于各种品牌的荧光定量?PCR 仪、恒温荧光扩增仪器等荧光检测设备。

正、反向引物建议的设计长度为30 ~?35?nt之间，长度通常长于PCR引物。引物过短可能会降低反应重组率，响扩增速度和检测灵敏度；引物过长则有可能形成二级结构而影响扩增。引物浓度应根据模板的浓度进行筛选，以确定最佳浓度，提升扩增效率。扩增片段的长度推荐为150 ~?300?bp，通常不超过 500 bp。注意，模板DNA片段过长或出现重复序列时，扩增的准确性会降低。

在正、反向引物中间，设计一段长度为?46 ~ 52 nt 与目的片段互补的探针序列。探针序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。探针序列共有四个修饰位点：距离 5’端的≥35 nt 的中部位置标记一个dSpacer（四氢呋喃，THF），作为核酸外切酶的识别位点；THF 位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个粹灭基团，两个基团的间距为 2 ~ 4 nt；THF 距离 3’末端≥15 nt，并且 3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或 C3-Spacer。