Tiosbio? RT RAA核酸扩增试剂盒（试纸条法）

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Fri, 22 Mar 2024 08:23:45 +0000
SNP可视化检测系统, DNA扩增, JY0204, 核酸扩增

本试剂盒利用特殊修饰的反转录酶以特异性引物作为转录引物，将体系内的RNA逆转录为cDNA，并以重组酶介导等温核酸扩增（Recombinase Aided Amplification，RAA）技术对检测目标序列进行扩增。扩增体系含有正、反向扩增引物和探针。将一条引物/探针标记生物素（Biotin），另一条引物/探针标记异硫氰酸荧光素（FITC）或6-羧基荧光素（6-FAM），探针经过nfo 酶的切割和RAA后，形成了带有两种标记物的双链扩增产物，该产物可使用胶体金技术（三明治夹心法）进行检测。

在等温条件下（通常为39℃），RAA体系内的重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体 Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白 SSB 的帮助下，侵入双链DNA 模板；在侵入位点形成 D-loop 区域，并开始对 DNA 双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体 Rec/ssDNA 解体的同时，聚合酶也结合到引物的 3′ 末端，以样品DNA为模板，12 ~?20?min即可实现对目的基因片段的高效扩增。

正、反向引物建议的设计长度为30 ~?35?nt之间，长度通常长于PCR引物。引物过短可能会降低反应重组率，响扩增速度和检测灵敏度；引物过长则有可能形成二级结构而影响扩增。引物浓度应根据模板的浓度进行筛。匀范ㄗ罴雅ǘ龋嵘┰鲂。扩增片段的长度推荐为150 ~?300?bp，通常不超过 500 bp。注意，模板DNA片段过长或出现重复序列时，扩增的准确性会降低。

在正、反向引物中间，设计一段长度为?46 ~ 52 nt 与目的片段互补的探针序列。探针序列的5′末端修饰抗原标记（Biotin 或FITC/6-FAM），5′末端和 3′末端的中部位置标记1个 dSpacer（四氢呋喃，THF），作为 nfo 的识别位点，3′末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或 C3-Spacer 等。